2 Раздел ИММУНОЛОГИЯ

Тема: Реакция агглютинации и её модификация (РА)

Цель занятия: Ознакомиться с сущностью реакции агглютинации, применением её в ветеринарно-лабораторной практике, получением и подготовкой компонентов; освоить методику постановки реакции агглютинации (РА) классическим объемным (пробирочным) и капельным методами

Материалы и оборудование: Аппарат Флоринского для разлива сыворотки крови, пробирки агглютинационные (бактериологические) с ровным сферическим дном, пипетки, градуированные на 1 и 5 мл, стерильные пастеровские пипетки и штативы, сыворотка крупного рогатого скота позитивная (бруцеллезная), сыворотка нормальная (здорового) крупного рогатого скота (часть пробирок с нормальными и позитивными сыворотками нумерована - шифр для исследования, другая часть для контроля остается под названием «позитивная» и «нормальная»), антиген для РА (единый бруцеллезный), пробирки с физраствором NaCl, резиновые груши. Для демонстрации необходимы таблицы, пробирки с положительной и отрицательной РА, пробирки с кольцевой положительной и отрицательной реакцией и молоком (КР).

Задание:

1 Ознакомиться со схемой и методикой постановки пробирочной и

капельной РА по таблицам.

2 Приступить к постановке РА самостоятельно, используя указания

преподавателя.

3 Изучить технику учета РА по демонстрационным рядам пробирок с

положительной, отрицательной и сомнительной РА.

В основе всех серологических реакций лежит комплекс антиген-антитело.

Антигены - генетически чужеродные вещества, которые при введении в организм животного вызывают специфическую перестройку лимфоретикулярной ткани, сопровождающуюся выработкой антител.

Различают антигены:

- Корпускулярные (бактерии, эритроциты);

- Растворимые (молекулярно-дисперсные);

Антитела — высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины).

По взаимодействию с антигеном in vitro (в пробирке) различают антитела:

- Агглютины - вызывают склеивание корпускулярного антигена (агглютиногена и осаждение комплекса антиген-антитело (агглютината);

- Преципитины - образуют преципитат с растворимым антигеном (преципитиногеном);

Бактериолизины;

- Гемолизины;

- Нейтролизующие антитела.

Осадочные серологические реакции протекают в две фазы:

1 Специфическая невидимая простым глазом, происходит образование комплекса антиген-антитело;

2 Неспецифическая, проявляется конечный эффект - осаждение агглютината.

Серологические реакции применяются для:

1 Определения антител в сыворотке животного с помощью известного антигена;

2 Определения специфического антигена с помощью специфических гипериммунных сывороток;

3 Установления видовой принадлежности возбудителя болезни, выделенного из исследуемого материала;

4 Для оценки естественного и искусственного приобретенного иммунитета.

Реакция агглютинации (РА) - проявляется в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфические антигену антитела, к взвеси клеток антигена происходит их склеивание, образование глыбок, комочков, хлопьев, которые оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок, а жидкость над осадком просветляется.

РА используют для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза (вибриоза), лептоспироза, сальмонелеза, колибактериоза и др.

Существует несколько методов РА:

- пробирочный; капельный;

- - реакция Кумбса;

- по методу Кастеллани;

- кольцевая реакция с молоком (КР);

- реакция гемагглютинации.

1 Для определения антител в сыворотке крови берут 5-10 мл крови из яремной вены животного и ставят в теплое место. После образования сгустка его отделяют от стенок пробирки и ставят в холодное место. Сыворотку отделяют в стерильные пробирки, нумеруют, отправляют с нарочным и сопроводительным письмом в лабораторию.

2 Антиген для РА - представляет стандартный антиген (взвесь убитых или живых бактерий в физрастворе).

3 Специфические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках.

1 Классический (пробирочный) метод РА. На каждую сыворотку берут четыре пробирки. В первую вносят 2,4 мл, а в последующие по 1 мл изотонического раствора хлористого натрия (физраствор). К физраствору в 1 пробирке добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки, получается основное разведение 1:25. Из основного разведения 1 мл переносят во вторую пробирку (1:50), из второй в третью (1:100), из третьей в четвертую (1:200), из четвертой пробирки 1 мл разведения удаляют в сливную чашку. Из первой пробирки -0,5мл. разведения также удаляют в сливную чашку. Затем во все пробирки добавляют по 0,05 мл антигена, пробирки ставят в термостат на 4 часа, выдерживают при комнатной температуре 18 часов и читают реакцию визуально:

+ + + + (#) - осадок в виде раскрытого перевернутого белого кружевного зонтика, жидкость прозрачная (100% РА) - пол.

+ + + (+ + +)- неполное просветление жидкости, зонтик хорошо выражен (75% РА)- пол.

+ + (++)- заметное просветление жидкости, зонтик выражен умеренно (50% РА) - пол.

+ - едва заметное просветление жидкости, зонтик слабо выражен (25% РА) - отр.

- (-) - просветление жидкости и зонтик отсутствует, на дне пробирки «пуговка» - компактный осадок клеток антигена - отр.

2 Капельный метод РА. На предметное стекло наносят каплю специфической сыворотки и отдельно каплю физраствора (контроль). В каждую каплю добавляют культуру испытуемого микроба по 1 капле. Положительная реакция указывает на гомологичность антигена с антителами.

3 Кровекапелънып метод РА (ККРА). Применяют для диагностики пуллороза птиц.

На предметное стекло наносят каплю крови (из гребешка или сережки) и добавляют каплю стандартного антигена и каплю пуллорозного эритроцитарного антигена (для получения видимости гамагглютинации). Через 30-60 секунд в капле смеси появляются глыбки, хлопья.

4 Пластинчатая РОЗ - бенгаловая проба (РПБ) - для диагностики бруцеглеза.

0,03 мл исследуемой сыворотки крови вносят на дно лунки эмалированной пластины. Затем вносят 0,03 мл бруцеллезного антигена, окрашенного бенгальским розовым и смешивают покачиванием 4 мин.

5 Кольцевая реакция с молоком (КР) при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и контроле сборного молока.

В пробирку наливают 2-3 мл свежего молока и добавляют антиген окрашенный гемотоксилином по 0,2 мл (2 кап.). Пробирки встряхивают и выдерживают в водяной бане (или термостате) при температуре 37°С 45-60 мин.

При положительной реакции образуется синее кольцо в нижнем слое сливок, столбик молока обесцвечивается.

При отрицательной реакции синяя окраска всего молока.

Контрольные вопросы:

1 Антигенное строение микробной клетки.

2 Различия антител по проявлению их действия in vitro.

3 Компоненты, техника постановки пробирочной РА, ее учет.

4 Сущность и техника постановки капельной РА и кольцевой реакции с молоком.